2020年6月11日之前，北京已連續(xù)56天無(wú)新增新冠病例。然而就在此時(shí)，北京新發(fā)地市場(chǎng)突然出現(xiàn)了1例新冠病毒感染者，并且引發(fā)了一波疫情。他是從何處感染了新冠病毒？來(lái)自中國(guó)的科學(xué)團(tuán)隊(duì)展開(kāi)了追蹤。

在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所、北京地壇醫(yī)院、清華大學(xué)、北京市疾病預(yù)防控制中心、北京大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所等的共同努力下，科學(xué)家最終將“疑兇”鎖定在境外冷鏈進(jìn)口食品上。這也是中國(guó)科學(xué)家第一次提出新冠病毒可能在冷鏈中傳播的發(fā)現(xiàn)。隨后，在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)也都發(fā)現(xiàn)在冷鏈?zhǔn)称繁砻鏅z測(cè)出新冠病毒核酸，并且中國(guó)疾控中心在青島在冷鏈?zhǔn)称返谋砻娣蛛x出新冠病毒。所以這也從另一個(gè)方面提示冷鏈?zhǔn)称吩谛鹿诓《緜鞑ブ械闹匾浴?/p>

近日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院副院長(zhǎng)王健偉在北京舉行的2020未來(lái)科學(xué)大獎(jiǎng)周“病毒與人類(lèi)健康”主題論壇上詳解了這背后的發(fā)現(xiàn)之旅。

王健偉表示，2020年6月11日的病例發(fā)現(xiàn)以后，通過(guò)對(duì)患者軌跡的追溯，北京有關(guān)部門(mén)對(duì)他的密切接觸者和接觸的環(huán)境樣本進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)兩份來(lái)自新發(fā)地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的樣本是新冠病毒的核酸檢測(cè)陽(yáng)性。在這個(gè)基礎(chǔ)上，對(duì)新發(fā)地進(jìn)行了擴(kuò)大檢測(cè)，在538份樣本中檢測(cè)出45份呈陽(yáng)性。所以這就提示新發(fā)地在疫情發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。因此，北京市有關(guān)部門(mén)在2020年6月13號(hào)果斷關(guān)閉了新發(fā)地市場(chǎng)。市場(chǎng)關(guān)閉以后，在全市采取了嚴(yán)格的管控措施，病例數(shù)量迅速下降，到2020年7月初，基本上沒(méi)有新發(fā)的病例，疫情得到了有效的控制。

新發(fā)地是北京最大的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，有超過(guò)5000以上的攤位，每天的客流量有5萬(wàn)以上，它的疫情得到了高度重視。北京市有關(guān)部門(mén)對(duì)新發(fā)地的員工進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)在3300多位員工當(dāng)中有169位是新冠病毒核酸陽(yáng)性。在關(guān)閉市場(chǎng)之前，從5月底到關(guān)閉市場(chǎng)之前的10多天中，有55萬(wàn)顧客到訪(fǎng)過(guò)新發(fā)地。通過(guò)對(duì)他們的追蹤，發(fā)現(xiàn)有103例是新冠病毒陽(yáng)性。在這個(gè)基礎(chǔ)上，對(duì)全市1000萬(wàn)人進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)96人是陽(yáng)性。截至2020年7月10日，總共發(fā)現(xiàn)了368名感染者。

“確定感染之后我們就需要回答幾個(gè)問(wèn)題”，王健偉稱(chēng)，“第一就是病毒是什么時(shí)候進(jìn)入新發(fā)地市場(chǎng)的？我們把所有的病例做一個(gè)時(shí)間的分布，因?yàn)樾鹿诓《靖腥镜臐摲谝话阍?4天以?xún)?nèi)，所以從6月初的病例往前推，我們推斷應(yīng)該是在5月底，這個(gè)病毒侵入到了市場(chǎng)中。橙色的代表市場(chǎng)的員工，黃色代表市場(chǎng)的顧客，藍(lán)色的病例代表沒(méi)有市場(chǎng)接觸史的感染者，但是他們都是這些病例的密切接觸者。這些病例基本上都和新發(fā)地有直接或間接的關(guān)系，所以新發(fā)地是這次疫情唯一的來(lái)源?！?/p>

在這個(gè)基礎(chǔ)上需要進(jìn)一步回答：既然新發(fā)地是疫情的來(lái)源，那么它的源頭是在哪里？北京市有關(guān)部門(mén)對(duì)新發(fā)地內(nèi)環(huán)境樣本和從業(yè)人員進(jìn)行了檢測(cè)，包括交易大廳的負(fù)一層，檢測(cè)了584個(gè)人，其中有122人是陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)20.9%。市場(chǎng)上的其他廳檢測(cè)了2727人，47人陽(yáng)性，陽(yáng)性率只有1.7%。所以交易大廳引起了高度的關(guān)注。交易大廳分成幾個(gè)區(qū)，包括海鮮區(qū)、展柜區(qū)、豆制品區(qū)和牛羊肉區(qū)。通過(guò)對(duì)這幾個(gè)區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，海鮮區(qū)的檢出率是最高的，高達(dá)50%以上。而且按照每個(gè)攤位的檢出率來(lái)看，S14號(hào)攤位的檢出率是最高的。“我們對(duì)一些攤位的環(huán)境樣本和人員樣本都進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有14個(gè)攤位的工作人員和環(huán)境樣本都是陽(yáng)性的，所以我們就把這14個(gè)攤位作為研究的重點(diǎn)?！?/p>

因?yàn)楸本┊?dāng)時(shí)沒(méi)有疫情傳入，而且在這之前也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感染者，所以病毒極有可能是從新發(fā)地的環(huán)境當(dāng)中來(lái)的，因此科研團(tuán)隊(duì)就對(duì)這些攤位進(jìn)行了重點(diǎn)的研究。對(duì)2020年5月下旬到6月12日之前到訪(fǎng)的這14個(gè)攤位的3200多名顧客進(jìn)行了抗體的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有5位顧客的抗體是陽(yáng)性的，而恰好這5位顧客在5月30日和31日都到訪(fǎng)過(guò)S14這個(gè)攤位，而且這5個(gè)人和他的密切接觸者，14天內(nèi)都沒(méi)有到訪(fǎng)過(guò)其他的中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，也沒(méi)有接觸過(guò)來(lái)自中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的人員，所以可以排除是外來(lái)的感染。在這個(gè)基礎(chǔ)上，科學(xué)家對(duì)他們到訪(fǎng)的攤位進(jìn)行了研究。

顯示S14攤位感染的比例是最高的，7個(gè)員工全部都感染了，而且抗體的陽(yáng)性率也是最高的。另外，從發(fā)病的時(shí)間來(lái)看，他們的發(fā)病時(shí)間在發(fā)病的感染者當(dāng)中也是比較早的。這個(gè)攤位的所有工作人員14天以?xún)?nèi)都沒(méi)有到訪(fǎng)過(guò)其他的中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，也沒(méi)有接觸過(guò)來(lái)自中高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)的人員，所以提示S14攤位可能是感染的源頭。

王健偉表示，接下來(lái)需要確認(rèn)的是，既然是環(huán)境樣本可能造成暴露，那么病毒是從哪兒來(lái)的呢？把流行病學(xué)和測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的基因組流行病學(xué)，對(duì)于追蹤傳染的來(lái)源是一個(gè)非常有用的工具。但在環(huán)境樣本中，病毒的含量是特別低的，而且樣本量又非常大，通過(guò)高通量測(cè)序有一定困難?！八?，我們?cè)诒本┐髮W(xué)謝曉亮教授的支持下，清華大學(xué)王建教授的團(tuán)隊(duì)也開(kāi)發(fā)了一種基于SHERRY的Minerva技術(shù)，通過(guò)這個(gè)技術(shù)可以把文庫(kù)構(gòu)建的速度縮短到5個(gè)小時(shí)以?xún)?nèi)，測(cè)序的速度更加快捷；另外，還建立了基因組富集的方法，使載量很低的樣本能夠得到有效測(cè)序?！?/p>

王健偉介紹，基于這樣一個(gè)技術(shù)體系，科學(xué)家通過(guò)合作，對(duì)110份新冠病毒陽(yáng)性的感染者和環(huán)境樣本進(jìn)行了病毒基因組測(cè)序，得到了72條高質(zhì)量的全基因組序列，包括56條感染者的基因組序列和16條環(huán)境樣本的基因組序列。環(huán)境樣本的病毒載量都是非常低的，“但是通過(guò)這樣的方法我們也得到了它的全序列。對(duì)于這個(gè)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，每一條序列上都有8個(gè)突變的位點(diǎn)，有53%的序列只有這8個(gè)突變，其余的序列還有其他一些突變，這就說(shuō)明這些突變是單一的來(lái)源，從病毒基因組的層面也證明新發(fā)地的感染是單一來(lái)源的?！?/p>

在這個(gè)基礎(chǔ)上王健偉等科學(xué)家做了病毒的進(jìn)化樹(shù)分析，“就像我們排家譜一樣，看看誰(shuí)跟誰(shuí)更近。在那個(gè)時(shí)間段，在吉林和黑龍江也有疫情，但是我們發(fā)現(xiàn)，來(lái)自北京新發(fā)地的序列和北京在3月份之前流行的毒株、當(dāng)時(shí)在黑龍江和吉林流行的毒株都是不一樣的，但是和在國(guó)外流行，特別是在歐洲等地流行的毒株突變位點(diǎn)是相同的，說(shuō)明這個(gè)毒株不是來(lái)自于國(guó)內(nèi)，而是來(lái)自于境外。那么境外是從哪兒來(lái)的？因?yàn)槭袌?chǎng)里面有兩個(gè)攤位是售賣(mài)三文魚(yú)的，其中S14攤位是自己在市場(chǎng)內(nèi)切割，這兩個(gè)攤位中的另外一個(gè)攤位沒(méi)有病例，而S14攤位員工全部感染，并且他們賣(mài)的商品中只有三文魚(yú)是從境外進(jìn)口的。”

為了進(jìn)一步追溯感染的來(lái)源，科學(xué)家對(duì)三文魚(yú)進(jìn)行了檢測(cè)。攤位在5月30號(hào)曾經(jīng)購(gòu)入了一家公司的三文魚(yú)，這個(gè)三文魚(yú)是從境外進(jìn)口的。對(duì)市場(chǎng)內(nèi)所有的三文魚(yú)的供應(yīng)商倉(cāng)庫(kù)的3000多份三文魚(yú)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有6份是陽(yáng)性，而其中5份是來(lái)自X公司。因?yàn)?月30號(hào)S14號(hào)攤位購(gòu)入的三文魚(yú)已經(jīng)賣(mài)完了，所以很遺憾，無(wú)法得到魚(yú)的樣本。但是科學(xué)家從一份沒(méi)有開(kāi)封的魚(yú)體表面，通過(guò)測(cè)序得到了覆蓋55%的基因組序列。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)序列，和前面在新發(fā)地測(cè)得的流行毒株的序列是一致的，也有這些相同的基因突變的位點(diǎn)。“所以這就提示，盡管我們因?yàn)闃颖驹驔](méi)有分離到這個(gè)病毒，無(wú)法證明它的感染性，但是可以提示進(jìn)口的冷鏈?zhǔn)称房赡苁遣《镜膫鞑ポd體。這也是第一次提出了這樣的一個(gè)發(fā)現(xiàn)。隨后在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)也都發(fā)現(xiàn)在冷鏈?zhǔn)称繁砻鏅z測(cè)出新冠病毒核酸，并且中國(guó)疾控中心在青島在冷鏈?zhǔn)称返谋砻娣蛛x出新冠病毒。所以這也從另一個(gè)方面提示冷鏈?zhǔn)称吩谛鹿诓《緜鞑ブ械闹匾??！?/p>

在新發(fā)地新冠病例的溯源中，宏基因組技術(shù)發(fā)揮了巨大的作用。

王健偉表示，近年來(lái)，高通量的宏基因組測(cè)序技術(shù)逐漸得到了應(yīng)用，并且發(fā)揮了重要的作用，特別是在病原體的診斷當(dāng)中，發(fā)揮“一錘定音”的作用。宏基因組技術(shù)用于病原體的檢測(cè)有很多的優(yōu)勢(shì)。一是和PCR這些序列依賴(lài)的方法相比，它是非序列依賴(lài)性的，所以不需要預(yù)知任何病原體序列信息就可以進(jìn)行檢測(cè)。

二是病原體檢測(cè)的靈敏度比較高。三是檢測(cè)的通量高，可以同時(shí)檢測(cè)上萬(wàn)種病原微生物的物種，也可以發(fā)現(xiàn)可能的共感染。四是檢測(cè)效能高，通過(guò)一次測(cè)序就可以拼接出病原體的基因組序列，不需要再重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。五是解析的深度深，可以同時(shí)分析病原體的變異和耐藥等情況。最后，它獲取的信息全，除了獲取病原的序列之外，還可以同時(shí)獲取宿主的基因組和轉(zhuǎn)錄組的信息，為預(yù)警和臨床診療提供基礎(chǔ)。